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高质量DNA获取方法之月桂酸钠法

编辑时间:2016.7.12

从组织中获取DNA难吗?不难,真不难。高一就有开设的从鸡血中获取DNA的生物实验课,很简单的几步就可以得到DNA。但要想获取高质量的DNA,尤其是从一些富含多糖、多酚、淀粉、纤维和蛋白的组织,后面用于酶切、高通量测序大片段文库的构建,还是有一定的难度的。
 
最近协助北京农业生物技术研究中心一个老师提取桃叶片DNA还是遇到了一些困难,因为老师要做桃的个体重测序,因此对DNA的要求还是非常高的。之前跟其他很多老师交流植物DNA的提取,大多数目前仍然使用CTAB法,有些老师购买试剂盒进行提取,其实很多植物DNA提取试剂盒成分也是CTAB。CTAB法是提取植物DNA非常经典方法,但在提取的过程中由于要在65℃水浴中放置1个小时,因此耗时较长。我们在使用该法提取桃DNA时,获得DNA中含有大量的蛋白和多糖,虽然通过多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除,但DNA得率较低。在这里给大家分享一种快速获取植物高质量DNA的方法,供大家在提取植物DNA时作为参考,用该法提取的植物DNA完全满足后续酶切、BAC文库构建、高通量测序大片段文库构建,将该法称之为月桂酸钠法。
 
月桂酸钠抽提缓冲液:
Tris-Hcl(pH8.0)100mmol/L;NaCl 100mmol/L;EDTA(pH8.0)20mmol/L;月桂酸钠 1%;
 
配法:准确称取NaCl 5.844g,月桂酸钠 10g置于1000mL烧杯中,加入100ml Tris-Hcl(1M)以及40mLEDTA(0.5M)、800mlddH2O,用盐酸调节pH至8.0,定容至1000 mL,灭菌后室温保存。
 
月桂酸钠英文名称:sodium lauroyl sarcosine  分子式:C15H28NaO3N,分子量:293.39。
 
以该法大量获取玉米叶片DNA为例的实验流程:
(1)选取适量的玉米幼苗新鲜叶片,以纱布捆扎,做好标记,置于液氮中保存;
(2)研钵以液氮预冷,将玉米叶片置于研钵中,倒入液氮,迅速研磨至粉末级,期间时时加入液氮,防止研磨过程中DNA被降解;
(3)将研磨好的粉末移入灭菌后的50mL抽提试管中,用移液管加入10mL月桂酸钠抽提缓冲液,反复缓慢的摇匀;
(4)用移液管向50mL抽提试管中加入等体积(10mL)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),反复缓慢的摇匀;
(5)12000 rpm,4°C离心20min后取出,小心吸取上清液16mL于新灭菌的50ml抽提试管中;
(6)向上述抽提试管中加入12mL异丙醇,上下缓慢颠倒数次,有白色絮状沉淀析出,颠倒时注意往一个方向,防止沉淀散开,不利于后续实验;
(7)将白色絮状沉淀用枪头从抽提试管中轻轻挑出,至于2mL EP管中;
(8)向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇,反复轻轻震荡洗涤,4°C,12000 rpm,高速离心15min,弃上清,重复此步骤两次;
(9)将得到的白色沉淀再次4°C,12000 rpm短暂离心数秒,以移液器吸干残留乙醇;
(10)白色沉淀置于37°C干燥箱中,使残存的70%乙醇全部挥发干净,这个过程中要经常拿出观察,防止过度烘干,不利于后面溶解;
(11)待白色沉淀变透明后,向2mLEP管中加入0.9mLTE缓冲液(pH8.0),放置于65℃恒温箱中,期间轻微弹匀,使DNA充分溶解;
(12)DNA完全溶解后,加入5μL RNase(0.1mg/mL),置于37°C干燥箱中30min,消化RNA,取出3μL,以1%琼脂糖胶检测是否有RNA残留;
(13)待RNA消化完成后,向EP管中加入等体积(0.9mL)氯仿,轻轻摇匀;
(14)4°C,12000 rpm高速离心15min;
(15)吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中,加入1/10体积(约0.07mL)NaAc(3M/L)溶液,轻轻摇匀;
(16)向上述EP管中加入等体积(0.7mL)异丙醇,轻轻摇匀后,于-20°C静置20min;
(17)4°C,12000 rpm高速离心15min,弃上清;
(18)将得到的白色沉淀以70%乙醇洗涤两次,去除残留的乙醇;
(19)白色沉淀置于37°C干燥箱中,使残存的70%乙醇全部挥发干净,该过程中要经常拿出观察,防止烘干过度,不利于后面溶解;
(20)待白色沉淀变透明,管中无残留的乙醇味后,加入200μL TE(pH8.0),于37°C干燥箱中溶解;
(21)待DNA完全溶解后,取出1μL,以分光光度计测定OD值,分装后于保存(-20°C)。

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